0571-87213919


技术支持 NEWS INFORMATION

6600公海下载网址 > 技术支持 > 多肽技术及文献
  • 多肽纯度检测、氨基酸分析及净含量理论计算
  • 本站编辑: 杭州肽佳生物科技有限公司发布日期:2019-11-27 10:25 浏览次数:

 多肽冻干粉主要由:肽类物质(目的肽、杂肽)、结合的盐离子、水份组成。

肽的纯度是指在波长214nm时样品中目的肽所占肽类物质的比例,样品中可能含有缺失序列、短片段、脱保护不完全的序列等等。肽的纯度是在肽的最大吸收峰214nm处由HPLC分析而得到的,肽中所含有的水份和盐份,未在肽的纯度中体现。
     肽的含量是指所有肽类物质在样品中所占的百分比,样品中包含所有的肽及水分、盐分等,肽的含量可通过氨基酸分析得到。

     根据总重和HPLC分析的纯度以及氨基酸分析结果,样品中目的肽的含量是如何确定的呢?一般多肽的重量是以总重来计算的,也就是肽冻干后的实际重量,其中包括在冻干过程中,其它非肽类杂质如残留的水分、来自带相反电荷离子的盐分等的重量。即多肽重量为:总重*多肽含量(氨基酸分析所得结果)。 目的肽的绝对含量是指在样品中目的肽的纯度与其含量的乘积,即目的肽的含量=总重*多肽含量*多肽纯度。

     多肽的含量可以通过氨基酸分析而得,也可以通过计算获得其理论值。

     通常多肽中含有3-5%的水份。

     盐份可按下列方式计算。例如多肽结合的为阴离子其分子量为m(比如三幅乙酸根,分子量为114),多肽的分子量为MW,多肽序列中含有n个碱性基团(包括N端的NH2),则一个多肽分子理论上可结合n个阴离子。其盐份含量=n*m/(n*m+MW)
   多肽含量=1-水份含量-盐份含量=1-(3%~5%)- n*m/(n*m+MW)。

     同理,如果多肽结合的是阳离子,需要计算多肽中酸性基团的个数。

     如果您需要半定量实验,可以通过理论计算获得多肽含量数据;如果您的实验需要精确定量,建议购买氨基酸分析服务,以便获得更精确的实验数据。

 

药物多肽的检测与分析

     由于多肽化合物的结构及理化性质的特点,用于定性及定量分析普通有机化合物的许多常规方法:熔点、沸点、红外光谱、核磁共振谱等均不能很好的对多肽进行分析。因此,多肽化合物作为药物时一般不以上述分析数据为纯度及结构确证的依据。在多肽分子的立体化学分析方面,越来越多地采用旋光色散(ORD)、圆二色散(CD)及二维核磁共振谱进行分析。它们可以深入地阐明肽键的二级以至三级结构。这些研究对分析肽的立体化学尤其是整体构象与生物活性之间的关系是很有意义的,但在药品质量评审上尚不被列入标准。详细的肽立体化学与IR、UV、ORD及CD分析的关系已在彭师奇教授的<<多肽药物化学>>一书均有描述,此处不再重复。下面仅就适于肽化合物质量控制的几种必须的分析手段予以简介。


⑴ 质谱(MS)分析

     由于红外、紫外及核磁共振分析对大分子量的多肽化合物进行质控的作用不明显,分子量检测对肽的质量控制就显得格外重要。因为肽链在一般的质谱轰击条件下很容易断开,很难得到完整的分子峰,所以常常用条件温和的FAB-MS、ESI-MS、MALDI-TOF……等方式进行肽化合物的质谱分析。从一张合格的MS分析图谱上不但可以证明产物的分子量,而且也可从其他杂峰的存在与否评价主产物的纯度。

     有时,由于多肽的目标产物与杂质的MS非常接近,特别是脱酰胺的杂质与产品的MS只相差1,因此,对于原料药多肽产品采用高分辨率质谱进行质控是非常必要的。


⑵ HPLC分析

肽分析中的AAA及MS数值主要用在结构证明即定性方面。只有进行HPLC分析才能得知肽产物的具体纯度。应该注意的是,主峰的保留时间(R.T.)不宜过短(如小于8分钟)。这种情况下,一些杂质峰(如果存在的话)可能与主峰并在一起,无法有效分离。因此,主峰RT值适中的分离条件是质检的合理条件。HPLC分析的另一功用是也可以定性。当合成肽为已知物(如仿制药)时,就可以与标准品进行各自注射比较或混和同注射(co-injection)比较,确认产物含量情况、保留时间是否与标品一致。


⑶ 序列分析

     肽的一级结构除了各残基的含量组成外,各残基之间键合的顺序是必须要加以证明的。例如下面两个肽:H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met–OH(A肽)、H-Tyr-Gly-Met-Phe-Gly-OH(B肽),它们的结构组成相同,因而氨基酸分析及质谱分析结果均一致。(当然,他们在HPLC分析中的保留时间可能不同)其中A肽是具有免疫调节活性的,而B肽却没有什么生物活性。因此肽的序列连接情况不同,其理化性质及生物活性有很大区别。值得指出的是,从动、植物及人体分离出的肽必须进行序列分析,作为结构测定的重要依据之一。但化学合成的肽则不需要序列分析。因为合成工艺中的反应路线已经把各残基的连接顺序明确了,不可能出现上述A肽与B肽共存的情况。

     通常我们可以采用Edman降解方法进行肽序列的测定。


⑷ 比旋光度[α]

     常见氨基酸中,除了Gly残基以外,其余氨基酸均含有手性C原子,因此每个肽化合物均有特定的[α]值。在相对分子质量为500以下的寡肽分子中一级结构为主体,因此其[α]值是必须的质量依据之一。但当肽链长度达八个残基(有的文献认为六个残基)以上时就开始出现了二级以上的结构。此时每个残基中的α-C(即手性C)原子对整个分子的旋光贡献也不是仅有的因素了。分子内的二或三级结构会给肽分子带来新的不对称环境,而且这些不对称性又往往与浓度、分子间缔合程度、溶剂及温度等因素有关。例如,生长抑素十四肽(Somatostatin14)的[α]值在不同批号之间竟相差20度之多。因此,在各国的药典及新药质控标准中已不把[α]值作为必要的内容。


⑸ 氨基酸组成的分析(AAA)

     它可以准确地表达肽链残基种类数量的构成。因为如果合成中某一步或几步缩合不完全,就可能导致残缺肽(delation peptides)存在。尤其是采用固相合成方式,这些残缺肽不可能被及时清除,往往在最终裂解后与目标肽混在一起。而且因理化性质与目标肽很接近而难以完全分开。此时AAA值提供的各种氨基酸之间含量比就可以判断出残缺肽的存在及哪种残基缺失了。一般的标准为各氨基酸检测值与理论值偏差在5%之内是允许的。