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  • 引起多肽不稳定的原因
  • 本站编辑: 杭州肽佳生物科技有限公司发布日期:2019-11-27 10:29 浏览次数:

多肽的不稳定性是其制剂研究中存在的主要问题之一,其原因较多。但对某一个多肽来说引起不稳定的主要原因并不多。详细研究外界条件(如PH、温度、光照、氧浓度等)对多肽稳定性的影响有助于设计合理的制剂配方。尽管添加剂稳定多肽的机制还不十分清楚,使用添加剂仍是目前提高多肽制剂稳定性的主要手段之一。应用CD、DSC等分析手段可帮助快速筛选到合适的添加剂。

     引起多肽不稳定的原因

     1.脱酰胺反应

    在脱酰胺反应中,Asn/Gln 残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应的进行,在Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解,位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。

     2.氧化

     多肽溶液易氧化的主要原因有两种,一是溶液中有过氧化物的污染,二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中,Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。因此,多肽可以充N2气或其它惰性气体后,放在低温下保存;溶解时可以用脱气的溶剂进行溶解。

     3.水解

     多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂,尤其是Asp-Pro和Asp-Gly 肽键。

     4.重排

    多肽中的Asp-Gly 肽键在合成过程中容易发生重排,同样在纯化和保存过程中也有重排发生,只是比例较低。

     5.形成错误的二硫键

     二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键,导致三级结构改变和活性丧失。因此,含有二硫键的多肽需要恰当的保存,在保存过程中远离还原试剂和巯基试剂,以免二硫键断裂或错配。

     6.消旋

     除Gly外,所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的,易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp、His及C端的Cys残基最易发生消旋应。

     7.β-消除

    β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr 等残基都可通过β-消除降解。在碱性PH下易发生β-消除,温度和金属离子对其也有影响。

     8.变性、吸附、聚集或沉淀

     变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态,多肽往往更易发生化学反应,活性难以恢复。在多肽变性过程中,首先形成中间体。通常中间体的溶解度低,易于聚集,形成聚集体,进而形成肉眼可见的沉淀。

    蛋白质的表面吸附是其贮存、使用过程中遇到的另一个令人头痛的问题,如riL-2在进行灌注时会吸附在管道表面,造成活性损失。

 

多肽的保存

     多肽产品的稳定性不仅和多肽的序列有关,很大程度上也取决于生产工艺,不同的工艺得到的产品稳定性有很大差异,特别是含有Cys、Gln、Met、Asn、Trp等氨基酸的序列。

     需要长期保存的多肽,应以冻干粉形式存放在含有干燥剂的密封容器内,置于-20°C保存,-80°C效果更好,可以最大限度地避免多肽降解。这种储存方式可以使多肽可保存数年,避免了被细菌降解和氧化,也可以避免二级结构的形成。如果序列中含有Cys、Met等易氧化氨基酸,建议充氮气后低温保存。对于部分产品,可以加入稳定剂进行保存。

     另外,含有二硫键的序列,需要避免还原试剂或巯基时间的接触,否则易造成二硫键的交换而造成错误二硫键,或二硫键被还原造成二硫键打开,从而失去生物活性。